光学纯环氧化合物是制备许多医药、农药、天然活性物质的重要前体，烯烃不对称环氧化是制备光学纯环氧最直接有效的方法之一。苯乙烯单加氧酶可以催化部分烯烃不对称环氧化制备光学纯(R)-或(S)-环氧化合物。然而，该酶催化烯烃不对称环氧化的立体调控机制尚不清楚，阻碍了通过蛋白质工程改造获得立体选择性高且底物谱宽泛的酶制剂。
为解决上述问题，中国科学院成都生物研究所联合中国科学院深圳先进院以及河南农业大学，解析了(R)-选择性苯乙烯单加氧酶SeStyA晶体结构，结合计算模拟分析，阐释了(R)-选择性苯乙烯单加氧酶催化烯烃环氧化的立体调控机制，为构建催化不同底物的(R)-或(S)-立体选择性环氧化的突变体提供理论指导。
研究团队首先解析了来自链霉菌Streptomyces vilmorinianum的(R)-选择性苯乙烯单加氧酶SeStyA晶体结构（图1），结合分子动力学模拟，确定活性中心的A59、A312、S178和A219位点可能为控制该酶催化环氧化立体选择性的关键位点。通过点突变及分析，发现C=C近端残基（A59和A312）与远端残基（S178和A219）大小决定该酶催化的立体选择性。总体来说，立体选择性机制遵循“拔河”模式：大近端残基和小远端残基将该酶“拉向”(R)-立体偏好性，与之相反，小近端残基和大远端残基将该酶“拉向”(S)-立体偏好性。进一步，该“拔河”模式在其它苯乙烯单加氧酶AaStyA和NaStyA中得到验证（图2）。
图1.SeStyA晶体结构及影响其催化立体选择性的关键位点解析
图2. C=C的近远端残基对苯乙烯单加氧酶催化环氧化立体选择性影响
苯乙烯单加氧酶SeStyA (a和b), AaStyA (c和d), NaStyA (e和f) 及其突变体催化对氯苯乙烯 (a, c和e) 和苯乙烯 (b, d和f)环氧化。
在该“拔河”模式立体控制机制的指导下，研究团队深入地分析了各位点间的协同效应，并成功构建了一系列针对不同类型化合物具有优异的(R)-或(S)-立体选择性的突变体（图3）。
图3. SeStyA（左）及其突变体（右）立体选择性催化不同烯烃环氧化
与此同时，通过分子动力学模拟阐明了该“拔河”模式的分子基础。结果显示：底物在含大远端突变体S178Y中以Re-face构型结合的自由能低于Si-face构型，生成(S)-环氧产物；而底物在含大近端小远端突变体Mut4R（S178G/F57A/A312F/A59M）中以Si-face构型结合的自由能低于Re-face构型，生成(R)-环氧产物（图4）。因此，底物在酶催化活性中的结合构型决定了该酶催化的立体选择性。
图4. SeStyA及其突变体与不同构象底物的结合自由能分析
相关研究以“Structural and Mechanistic Insight into the Enantioselectivity of (R)-Selective Styrene Monooxygenases: A Tug-of-War between Proximal and Distal Residues"为题，发表于中科院一区TOP期刊Angewandte Chemie International Edition上（IF 16.9，1区top）。成都生物所博士研究生李执朴和中国科学院深圳先进院王兰腾为论文共同第一作者，河南农业大学林晖副教授、中国科学院深圳先进院周佳海研究员和成都生物所吴中柳研究员为共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金、国际访问学者计划、四川省自然科学基金等联合资助。